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层析介质的寿命与层析介质的清洗验证
 
       在近20-30年,生物技术在中国得到了迅猛的发展。随着生物制药技术的发展,生物药物的质量越来越得到重视。生物药物从研究到上市,其过程包括,实验室成果转化到临床试验,最终由患者广泛应用。药物研发成功的关键是药物的有效性,同时药物的安全性更为重要。我们需要在严格确保高质量的同时,不影响其有效性及工艺的稳定性。这就是法规部门的要求。
       清洗验证是工艺验证中的一项重要部分,验证是cGMP所要求的“证明任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统,确实能导致预期结果的有文件证明的一系列活动”。
在生物药物的生产过程中,层析技术是其中最关键的步骤。生物药物通过培养,收集,经过层析介质的纯化,最终得到符合要求的生物药物产品。在生物制药的分离纯化过程中,培养的物料通过层析介质分离纯化,得到符合要求的目标产品。同时,物料中的杂质也污染了层析介质。这些污染物包括:宿主的蛋白、核酸、脂类,培养过程中的代谢产物、内毒素、杂菌以及可能的层析系统的泄漏,试剂中的杂质。这些污染物在下一次的分离纯化中将污染目标产品。所以必须去除或将其降低到安全水平。这就是我们所提到的层析介质的清洗 (CIP) 过程。通过您的试验证明清洗有效且污染物的残留已经降低到安全水平的工作就是清洗验证。层析介质是一种消耗品,层析介质的经过一段时间使用,清洗后,污染物的残留量超过了安全水平,那么层析介质的寿命就到期了,只有更换新的层析介质才能保证生物药品的质量。
       1、层析介质寿命的影响因素:
       ●   物料的类型以及该层析介质所在工艺中纯化步骤
       ●   层析介质的类型
       ●   层析柱的维护
       ●   整个层析系统的组成
       ●   层析柱的装柱质量
       ●   试剂等的质量
       1.1 物料的类型: 物料是指生物生产过程中含有目标产品的料液。物料的类型是影响层析介质寿命的关键因素。不同的物料中含有的杂质不同。如:大肠杆菌的培养液中,培养液的上清液中约为10种蛋白,在外膜与内膜间的胞质中约含100种蛋白质,而细胞膜内的细胞质中含有2000种蛋白质,在细胞质中还含有核酸、脂类等非蛋白的杂质。所以如果您的物料是大肠杆菌的细胞破碎液,那么杂质就相当的多了。由于蛋白的种类不同, 所以在分离您的目标蛋白的时候,这些杂质可能发生沉淀、 变性、聚集等变化,污染堵塞层析介质。
       又如:在抗体生产中使用Protein A介质纯化。物料是CHO细胞表达的上清液。在培养过程中如果培养的条件控制较好,上清液的杂质相对较少,此Protein A的介质寿命就会较长。但是如果CHO细胞培养条件控制不好,细胞裂解,细胞中的蛋白/核酸等杂质就会影响纯化的条件,介质的寿命就会受到影响。如果想要延长介质的使用寿命,就必须使用较强烈的清洗条件清洗层析介质。例如: NaOH 或优化清洗剂的条件等。
       Streamline介质的设计用于捕获步骤,所以此介质易受杂质的污染,在清洗时需优化清洗试剂及步骤。
       物料:杂交瘤细胞上清
       层析介质:STREAMLINErProtein A
       在位清洗步骤:
       A: 1.0mM NaOH,2M Nacl 溶于 20% 的乙醇中,处理 2 小时,2500px/h 流速 
       B: 5% 月桂酰肌氨酸钠,20mM EDTA, 0.1M NaCl,20mM NaH2PO4, pH 7.5
       处理 1.5 小时
       C: 50mM HAC,20% 乙醇
       1.2层析介质所在的纯化工艺中的步骤: 在纯化的工艺开发过程中,我们建议采用三步法纯化工艺。 捕获→中度纯化→精纯→半成品。在三步纯化工艺中,不同的纯化步骤,其纯化工作的目的不同。捕获步骤主要的目的是:从大量的杂质中捕获目标样品,缩小样品的体积,以便于后续的纯化工作。所以此步骤的工作面临的是物料中有大量杂质。所以此步骤层析介质的清洗需要比较强烈的试剂, 因此捕获步骤的层析介质的寿命相对较短。
       在表1中血浆白蛋白纯化过程中使用的离子交换介质在不同 的分离步骤中,DEAESepharose Fast Flow阴离子交换介质,在此工艺中为捕获作用;CM Sepharose Fast Flow 为阳离子交换介质,工艺中为中度纯化;这两步离子交换均为3个循环做一次CIP。但是用于捕获步骤的阴离子交换介质 DEAE Sepharose Fast Flow的寿命明显短于中度纯化的CM Sepharose Fast Flow介质。
       1.3不同类型的层析介质:层析介质是由层析介质的基价(骨架) 配合各种配基形成不同原理的层析介质。凝胶过滤介质没有配基;离子交换、疏水 的配基为小分子的配基;亲和介质的配基一般为特殊的蛋白质。亲和介质的配基一般稳定性稍差,不耐受酸、碱等较强的清洗条件,所以对清洗的条件要求比较严格,较强的试剂清洗可能导致配基的脱落或降解。但是温和的试剂的清洗效果较差,这就造成层析介质的寿命缩短。
       Mabselect SuRe为新一代重组Protein A的亲和介质。对原有的 Protein A 的氨基酸序列作了突变。使其耐受 0.1- 0.5M NaOH,从而可以延长层析介质的寿命。图4为 Mabselect SuRe在 0.1-0.5M NaOH的条件清洗200个循环,其动态载量下降很少。
       图 3A: 为 40 min 6 M GuHCl 清洗后的 Mabselect 图片
       图 3B: 为 3 h 6 M GuHCl 清洗后的 Mabselect 图片
       图 3C: 为 40 min 0.1M 磷酸清洗后的 Mabselect 图片 
       图 3D: 为 40 min 0.1M NaoH 清洗后的 Mabselect 图片
       图 3E: 为 3 h0.1 M NaoH 清洗后的 Mabselect 图片 
       图 3F: 新的 Mabselect 层析介质 (未做任何处理) 图片
       上图说明:GuHCl 以及磷酸为清洗试剂处理后,介质表面的污染杂质没有完全去除,清洗效果较差。而NaOH的清洗效果是最好的。
       1.4层析介质的维护:层析介质的维护是层析介质寿命的关键。层析介质的维护包括层析介质的清洗,消毒,储存。层析介质的清洗步骤决定着层析介质的寿命。优化层析介质的清洗步骤包括以下几个因素:
       a. 清洗试剂与层析介质的兼容性。即层析介质在清洗时不会与层析介质的骨架发生作用,不会与配基发生作用。
       b.污染物 (物料中的杂质) 必须去除或污染物的水平降低到安全水平,污染物包括:细胞碎片,宿主的蛋白,宿主的 DNA,内毒素以及污染的杂菌。
       c.清洗试剂与层析介质的接触时间,适合的接触时间确保清洗的效果,但不破坏层析介质。
       d.清洗试剂处理层析介质时的温度。
       e.清洗试剂是否符合制药要求。
       例如:在去除阴离子交换中残留的小牛胸腺DNA的实验中可以使用 1 M NaOH + 1M NaCl 可以完全去除残留的DNA。但是在单抗纯化过程中,如果DNA的水平较高,即使使用 2M NaOH 或 3 M NaCl 都不能完全去除残留的DNA。如果使用DNA酶可以去除残留的DNA,但是DNA酶的使用需要法规部门的验证。所以在实际工作中,要评估清洗后层析介质的载样量/流速指标,是否恢复;产品的纯度以及DNA的杂质水平。
       NaOH被广泛用于清洗、消毒和保存层析介质及层析系统。使用NaOH的最大好处在于有效、低成本、并能容易检测、 清除和处理。NaOH一直被认为能有效去除蛋白和核酸。同时,它还能灭活大多数的病毒、细菌、酵母、真菌以及内毒素。在实际的工业生产中为了节约时间,在NaOH中加入氯化钠等盐物质,从而可将清洗和消毒两者进行结合。关于NaOH的清洗作用请参看 GEHealthcare公司的应用文献 18-1124-57 AF《氢氧化钠用于层析介质及系统的清洗和消毒》。
       1.4.2层析介质的消毒:层析介质的消毒主要作用是去除层析介质中的微生物以及内毒素等有害物质。在生产中一般不使用蒸汽或高压等常用的消毒方式,因为在清洗过程中使用了NaOH清洗试剂就可在清洗的过程中完成消毒的工作。
       1.4.3层析介质的储存:层析介质的储存指的是层析介质在层析柱中有一段时间不使用的情况下的保存。装好层析介质的层析柱储存时需要考虑以下几点:
       a.层析柱的储存时间。在使用前必须检测柱效以及储存后的层析柱是否有污染。
       b.层析柱的储存试剂。
       c.储存的温度。
       d.储存房间的空气质量。一般建议在万级房间并且空气湿度较小环境下储存,对于一般的层析介质来说使用 0.01M NaOH是一个较好的选择。但是亲和介质,如 Protein A类的介质,一般是用20%乙醇作为储存试剂。
       1.5层析系统的组成以及仪器的清洁:清洗试剂对层析系统的部件兼容性。主要是O- 型圈,管路以及泵等部件在清洗试剂的操作中是否会有泄漏,从而影响层析介质的寿命。
层析系统包括层析柱应该接受无菌的挑战试验。无菌挑战试验是指:层析系统以及层析柱 (已经装好层析介质) 在使用NaOH无菌消毒后是否可以保持无菌状态,没有细菌的残留以及内毒素的残留。
       2、层析介质寿命的判断标准:
       判断层析介质的寿命主要以下列参数与产品生产的SOP做对比,如不在 SOP 的控制范围内,说明层析介质应该更换了。
       1.产品的的性质:产品的纯度、收率
       2.杂质的性质:杂质的含量 (HCP、DNA、聚体)
       3.层析介质在生产中的参数:载量、洗脱峰的保留时间,洗脱峰的对称性等
       4.层析介质的运行的参数:压力、流速、柱高、再生、在平 衡的 UV/pH/Cond 等参数
       5.泄漏:层析介质的配基泄漏 (尤其为亲和介质的配基泄漏 是否在规定的水平)
       3、层析介质寿命的验证: 
       层析介质的寿命的验证是通过小规模试验模式(Scale-down) 验证介质的使用周期。需要中试和生产规模的分析。
       Scale-down 的验证策略 I ——预测的验证:
       ●   研究小规模每个循环的结果
       ●   评估层析介质的每一个 Nth循环的结果
       ●   评估层析介质的每一个 Nth+ 1 次的空白结果
       当层析介质寿命的小规模试验确定后,确认生产规模下的安全因子。
       小规模试验 (Scale-down) 设计要求:
       1.使用生产规模的生产物料
       2.与生产规模设计一致的层析系统以及层析柱
       3.装柱质量 (柱效以及对称性等) 与生产规模一致
       4.按照生产规模层析柱体积与样品的比例上样
       5.保持与生产规模一致的线性流速
       6.将生产规模中层析介质的储存时间记入循环时间中
       小规模试验的是验证生产规模的层析介质的寿命,规模缩小的多少没有固定的模式。对于一些比较昂贵的物料或是较昂贵的亲和层析介质来说,试验缩小到 2000 倍或更小是可以接受的。产品的接触时间是关键的参数必须在小规模试验中维持不变,其他需要维持不变的重要参数还有柱高,线性流速等。
       3.1首先:层析介质清洗试剂的选择
       在小规模(Scale-down) 试验前确定层析介质清洗和消毒的试剂。对于不同的污染物来说,有不同的清洗条件。以下介绍 不同的污染物使用的清洗试剂。
 
       3.1.1杂蛋白的清洗:在物料中含有大量的杂蛋白,这些杂蛋白根据性质不同,可分为:可溶性杂蛋白、沉淀在层析介质、疏水性蛋白、脂蛋白或脂类。参见下列内容:不同类型的杂蛋白的在位清洗程序。
       3.1.1.1可溶性杂蛋白的清洗方法
       a. 凝胶过滤介质:一般使用 0.1-0.5 M 的 NaOH 清洗
       0.5-1 个 (CV) 柱床体积;然后超纯水 1-2 CV
       b. 离子交换介质:2 M NaCl 清洗 0.5 CV;或至少接触 10-15 min
       c. 疏水层析介质:超纯水 (低离子强度的缓冲液) 清洗
       2-3 个 CV,或使用 30% 异丙醇清洗 2-3 个 CV
       d. 亲和层析介质:根据层析介质的性质使用适当的缓冲液清洗可溶性杂蛋白
       3.1.1.2沉淀蛋白的清洗方法
       a. 一般层析介质 (GF/IEX/HIC) 的方法:0.5-1 M NaOH 清 洗 3-4 个 CV,然后使用超纯水冲洗 pH 至中性
       b. 亲和层析介质:一般使用尿素或盐酸胍清洗 1-2 个 CV
       3.1.1.3疏水性杂蛋白或脂蛋白的清洗方法
       a. 一般层析介质 (GF/IEX/HIC) 的方法:0.5-1 M NaOH 清 洗 3-4 个 CV,然后使用超纯水冲洗 pH 至中性
       b. 亲和层析介质:一般使用尿素或盐酸胍清洗 1-2 个 CV
       3.1.1.4脂类杂质的清洗方法
       a. 0.5% 的非离子去污剂清洗 3-4 个 CV,对于吸附较强的脂类可以优化 70% 的乙醇或 30% 的异丙醇清洗
       3.1.2内毒素的去除 
       内毒素是生物制药工艺生产中必须去除的物质,NaOH对内毒素有较好的去除效果,在内毒素的去除试验中 0.5-1.0 M NaOH的浓度作用4-6 h会有较好的效果。但是在实际的生产中,如果是连续生产中的CIP时,一般使用 0.1-0.5 M NaOH 接触 15-30 min或清洗1个CV就可完成去除残余内毒素以及层析介质的消毒工作。对于已经保存了一段时间的层析介质,一般需要较长的时间,做去除内毒素与消毒工作。图8所示为不同浓度的 NaOH 去除内毒素所需的时间 (去除前溶 液内毒素浓度100 ng/ml)。在内毒素挑战试验中(Bioprocess 系统+BPG层析柱+QSepharose Fast Flow),上样中含1200 EU/ml 的内毒素,室温23h保存。使用 1 M NaOH去除系统中的内毒素,然后使用无菌水冲洗至pH中性。检测 TOC以 及 LAL。证明 1 M NaOH 处理1小时后可以对系统的内毒素完全去除。
 
       3.1.3核酸:
       核酸带负电,与阴离子交换吸附较强,实践证明 1 M NaOH+ 1 M NaCl 对核酸的去除效果较好。
       3.1.4病毒: 
       病毒的灭活在工业生产中是极为重要的。尤其是动物细胞来源的表达产物,对病毒的要求较高。NaOH对病毒的灭活有较好的作用,请参看GEHealthcare公司的应用文献18-1124- 57 AF《氢氧化钠用于层析介质及系统的清洗和消毒》。
       根据以上所述,NaOH在层析介质的清洗和消毒中有重要的作用,有时可以将NaOH的在位清洗(CIP) 与在为消毒 (SIP) 合并为一步,在 CIP的同时做消毒的工作。
       根据以上所述,NaOH在层析介质的清洗和消毒中有重要的作用,有时可以将NaOH的在位清洗(CIP) 与在为消毒 (SIP) 合并为一步,在 CIP的同时做消毒的工作。
       3.1.5在位清洗 (CIP) 的试剂与程序的选择时应当注意:
       a. 层析介质对 CIP试剂的耐受程度,最好选择厂家推荐的CIP试剂。
       b. 根据物料的不同选择不同的CIP试剂。
       c. 通过空白试验检测CIP的效果。
       一般的检测CIP的效果时,选用总有机炭测定仪-TOC来检测清洗的效果。总有机炭测定的是一种基于最坏结果的分析方法。此方法将清洗层析介质的液体通过TOC测定仪,测定层析介质内的有机物质的残留。而非检测特定物质的含量。
       3.2其次:在小规模试验中系统的选择也是非常重要的
       3.2.1层析系统:小规模系统与生产规模系统的材质、检测器、系统的滞留体积、系统的控制等设计保持一致。在小规模与生产规模的层析系统中不能有产品保留时间的漂移。
       ÄKTA系列层析系统的设计从小试到中试以及到生产采用同样的材质 (USPVI 标准),检测器 (紫外,电导,pH)、滞留体积比例一致以及Unicorn软件控制,确保scale-up以及scale- down的一致性。
       3.2.2层析柱: 在小规模试验与生产规模中的层析柱的设计同等重要,层析柱的液体分配器的一致性,以及层析介质的装柱的效果的一致性,均影响着scale-up与scale-down的效果,影响层析介质寿命的验证。

 


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